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Intro ......

 

IPTG가 포함되지 않았다는 의미이. , 얻고자 하는 DNA를 선별하기 위해서이다. repressor를 암호화하고 있는 조절유전자(regulatory gene)는 오페론 밖에 위치하고 있으며, trnasformation안된 것 ④ supernatant(상층액)을 버리고 pellet(하층에 남은 덩어리)만 남긴 후 sample buffer를 30㎕넣어준다. 이 경우 엠피실린 배지에서는 자라나(왜냐하면 엠피실린 저항성 유전자는 그대로 있으므로) 테트라사이클린 배지에서는 자라지 못하는(왜냐하면 삽입된 DNA에 의해 테트라사이클린 저항성 유전자는 불활성화되었기 때문에) 세균을 찾으면 될 것이다.hwp Colony overexpression. ⑤ water bath에서 5분간 boiling ⑥ pellet을 resuspension시킨다.Methods ① transformation된 E coli를 kanamycin(100 ug/ml)이 첨가된 LB배지에 접종 ② 섭씨 37도에서　 culture하여 흡광도 600nm에서　OD값이 0.Discussion (1) transformation된 E coli를 kanamycin이 첨가된 배지에 넣는 이유는 저항 유전자를 지닌,, 항상  ......

 

 

Index & Contents

Colony overexpression Down

 

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3.Methods

① transformation된 E coli를 kanamycin(100 ug/ml)이 첨가된 LB배지에 접종

② 섭씨 37도에서　 culture하여 흡광도 600nm에서　OD값이 0.6이 되도록 배양

③ IPTG를 농도가 1mM이 되도록 첨가, 발현 유도

3시간 Induction시킨 것 (조교들이 준비해줌) / 실험 시간에 1시간 induction시킨 것

transformation만 된것, trnasformation안된 것

④ supernatant(상층액)을 버리고 pellet(하층에 남은 덩어리)만 남긴 후 sample buffer를 30㎕넣어준다.

⑤ water bath에서 5분간 boiling

⑥ pellet을 resuspension시킨다.

⑦ centrifuging하여 pellet을 얻는다..

⑧ loading

 

4.Result

transformation되지 않은 것은 DNA 발현 조차 불가능 할 것이다.

induction을 하지 않은 것은 곧, IPTG가 포함되지 않았다는 의미이다. IPTG가 포함되지 않으면

전사되지 않고 유전자 발현이 일어나지 않는다. 그러므로 발현되지 않았을 것이다. induction의 기간의 조절한 것으로 보아 시간에 따른 차이가 있어야 할 것 같다. 전사후 단백질의 생성 정도는 시간이 길수록 더 많은 것이라 예상 된다. 곧, 1시간 induction시킨 것보다 3시간 시킨 것의 단백질 생성이 많을 것이다.

5.Discussion

(1) transformation된 E coli를 kanamycin이 첨가된 배지에 넣는 이유는 저항 유전자를 지닌, 얻고자 하는 DNA를 선별하기 위해서이다. 이와 비슷한 예로 DNA가 삽입된 플라스미드를 가지고 있는 세균을 찾는 방법 중 하나는 테트라사이클린(tetracycline)과 같은 항생제 저항성 유전자를 클로닝의 제한자리에 놓는 것이다. 이 경우 엠피실린 배지에서는 자라나(왜냐하면 엠피실린 저항성 유전자는 그대로 있으므로) 테트라사이클린 배지에서는 자라지 못하는(왜냐하면 삽입된 DNA에 의해 테트라사이클린 저항성 유전자는 불활성화되었기 때문에) 세균을 찾으면 될 것이다.

(2) Repressor라고 하는 억제자 단백질이 항상 operator에 붙어서 RNA 중합효소가 프로모터에 붙는 것을 방해하므로 전사는 일어나지 않는다. repressor를 암호화하고 있는 조절유전자(regulatory gene)는 오페론 밖에 위치하고 있으며, 항상 발현되어 억제자를 제공한다.

 

(3) 억제자가 항상 붙어있는데도 전사가 일어나는 이유는 락토오즈가 억제자와 결합하여 억제자의 모양을 변화시켜 억제자가 프로모터에 붙는 것을 방해한다. 즉 억제자의 형태가 변형되면 오…(생략)

 

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